Rekrudeszenz der Spermatogenese beim Hund nach gezielter Aufhebung der Downregulation der germinativen und endokrinen Hodenfunktion: Untersuchungen unter besonderer Berücksichtigung des Androgenrezeptors

Rekrudeszenz der Spermatogenese beim Hund nach gezielter Aufhebung der Downregulation der germinativen und endokrinen Hodenfunktion: Untersuchungen unter besonderer Berücksichtigung des Androgenrezeptors
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, weitere Einblicke in die testikuläre Rekrudeszenz und deren zeitlichen Verlauf nach gezielter Aufhebung der Downregulation der germinativen und endokrinen Hodenfunktion zu erhalten. Zudem sollten die Untersuchungen vergleichende Informationen hinsichtlich des Grades der downregulierenden Wirkung der slow release-Präparate „Gonazon®“ (enthält den GnRH-Agonisten Azagly-nafarelin, 18,5 mg) und „Profact® Depot“ (enthält den GnRH-Agonisten Buserelinacetat, 6,6 mg) liefern. Ein weiterer Aspekt der Arbeit bestand in der Gegenüberstellung von downreguliertem und juvenilem Hoden.
Versuchsdesign
Die Untersuchungen erfolgten an 38 adulten, geschlechtsgesunden Beagle-Rüden. Im Anschluss an eine erfolgreiche Aufnahmeuntersuchung wurden 5 Tiere chirurgisch kastriert und dienten als Versuchsgruppe „Kontrolle adult“. 30 Hunde wurden zur Herbeiführung der Downregulation mit „Gonazon®“ (Versuchsgruppe „Gonazon®“) und 3 weitere Hunde mit „Profact® Depot“ (Versuchsgruppe „Profact®“) behandelt.
Der Eintritt der Downregulation wurde mittels der Bestimmung von Testosteron (T), LH und FSH im peripheren Plasma kontrolliert. In Woche 0, d.h. 5 Monate nach Behandlungsbeginn, lag eine vollständige Downregulation vor, wie die zu diesem Zeitpunkt nahe oder unterhalb der Nachweisgrenze befindlichen Testosteronkonzentrationen ergaben. Auch die Messwerte von LH und FSH wiesen eine deutliche Erniedrigung auf.
In Woche 0 erfolgte die chirurgische Kastration aller Hunde der Versuchsgruppe „Profact®“. Zu selbigem Zeitpunkt wurde sämtlichen Tieren der Versuchsgruppe „Gonazon®“ das GnRH-Implantat entfernt und es erfolgte die chirurgische Kastration der ersten 3 Rüden dieser Gruppe. Von den verbleibenden Rüden wurden bis zur Woche 24 post explantationem (p.expl.) jeweils 3 bis 4 Rüden in 3-wöchigem Intervall kastriert. Im direkten Anschluss an die Kastration wurde das Hodengewebe präpariert und für die weiteren Untersuchungen konserviert. Das Hodengewebe von 3 juvenilen Rüden unbekannter Rasse (Versuchsgruppe „juvenil“) erfuhr eine entsprechende Aufarbeitung.
Datenanalyse
In der statistischen Auswertung wurden zum einen die Versuchsgruppen „Gonazon®“ [Developmental Group (DG) A bis DG D] und „Kontrolle adult“, zum anderen die Versuchsgruppen „Gonazon®“ DGA, „Profact®“ und „juvenil“ berücksichtigt. P-Werte ≤ 0,05 wurden als signifikant erachtet.
Versuchsgruppe „Gonazon®“
Die hormonelle Aufregulation, gemessen an der peripheren Testosteronkonzentration, erfolgte bei allen Rüden innerhalb von 7 Wochen. Die Rekrudeszenz des Keimepithels wies starke individuelle Unterschiede auf. Daher erfolgte die Gruppierung der Hunde nicht nach den Kastrationszeitpunkten, sondern nach dem am weitest entwickelten Keimzelltypus. Es ergaben sich folgende Entwicklungsgruppen: DG A [Spermatogonien (Spg) bis Spermatozyten (Spz), 4 Hunde], DG B [Spg bis runde Spermatiden (rSpt), 3 Hunde], DG C [Spg bis elongierende Spermatiden (eldSpt), 6 Hunde] und DG D [Spg bis elongierte Spermatiden (eltSpt), 17 Hunde]. Die Gruppen DG A, DG B und DG C setzten sich ausschließlich aus Rüden zusammen, deren chirurgische Kastration innerhalb von 9 Wochen p. expl. erfolgt war und die eine unvollständige Spermatogenese aufwiesen. Alle Rüden der DG D waren frühestens in Woche 9 p.expl. oder zu einem späteren Zeitpunkt kastriert worden und zeigten eine physiologische Spermatogenese.
Die detaillierte Charakterisierung des Keimepithels basierte beim Vorliegen einer unvollständigen Spermatogenese auf der Klassifizierung der tubulären Entwicklung [Tubulustyp (tt) a bis tt d2], wohingegen im Falle einer vollständigen Spermatogenese ein geringgradig modifiziertes Staging nach Russell et al. (1990b) angewendet wurde. Aufgrund des nahezu einheitlichen Verteilungsmusters der Stages bei den Rüden der DG D, erfolgte in dieser Gruppe im Hinblick auf die umfangreichen, nachfolgend beschriebenen Untersuchungen eine Reduzierung der Tierzahl auf 5 Hunde, welche nach dem Zufallsprinzip ausgewählt wurden.
Die Rekrudeszenz des Keimepithels war frühestens in der Woche 9 p. expl. abgeschlossen. Die Querschnittsfläche der Tubuli seminiferi contorti war positiv mit der fortschreitenden Entwicklung der Tubulustypen korreliert. Sie entsprach erstmals in der DGC den Ausgangsmaßen der „Kontrolle adult“, welche tendenziell noch von den Werten der DG D übertroffen wurden. Während – mit Ausnahme des in Woche 3 kastrierten Rüden Elias – bei den Hunden der DG A ein intratubuläres Lumen weitgehend fehlte, zeigte sich dieses wieder in der DG B. Auch die in der DG A tendenziell erniedrigte Anzahl von Spg erreichte in der DG B wieder die Ausgangswerte der „Kontrolle adult“. Die Zahl an Sertolizellen (SZ) schien keiner Veränderung durch die Downregulation unterlegen zu haben.
Die Expression des Androgenrezeptors (AR) im Verlauf der Rekrudeszenz wurde sowohl auf Protein- [Western Blot, Immunhistochemie (IHC)] als auch auf mRNA-Ebene (RT-PCR, RT-qPCR) erfasst. Der Nachweis des AR-Proteins gelang in den SZ, Spg, Leydigzellen (LZ) und den peritubulären Myoidzellen. Während die Anzahl AR exprimierender SZ in der DG A nur tendenziell erniedrigt war, ergab sich für die Anzahl AR exprimierender SZ in basaler Position ein signifikanter Effekt der Gruppe, mit dem niedrigsten Wert in DG A. Zudem war die Anzahl der basal gelegenen, den AR-exprimierenden SZ signifikant mit der fortschreitenden Entwicklung des Tubulustyps korreliert. Der relative Anteil der den AR exprimierenden Spg und LZ schwankte innerhalb der DGs von 14,3 % bis 23,8 % bzw. 42% bis 87%; ein signifikanter Effekt der Gruppe lag nicht vor. Sowohl in den SZ als auch in den LZ zeigten sich unterschiedliche Färbeintensitäten (FI) in der immunhistochemischen Darstellung des ARs. Die FI der AR-positiven SZ war signifikant positiv mit der fortschreitenden Entwicklung des Tubulustyps korreliert. Die AR-exprimierenden LZ waren mehrheitlich von schwacher FI [FI (1)]. Die Zahl der die FI (1) aufweisenden LZ war in DG A signifikant niedriger als in DG D. Die Expression des AR auf mRNA-Level unterlag keiner Beeinflussung durch die Downregulation.
Die Erfassung der Proliferation erfolgte durch immunhistochemische Darstellung der Expression von Ki-67. Positive Signale zeigten sich in Spg, primären und sekundären Spz, rSpt und vereinzelt auch in LZ. Aufgrund ihrer grundlegenden Bedeutung für die Spermatogenese wurden jedoch in sämtlichen Auswertungen lediglich die Spg berücksichtigt. Die Downregulation mit „Gonazon®“ bewirkte eine annähernd vollständige Aufhebung der proliferativen Aktivität in den Spg der DG A. Erst in der DG D waren wieder mit der „Kontrolle adult“ vergleichbare Werte nachweisbar. Die Anzahl der proliferierenden Spg war positiv signifikant mit der Entwicklung des Tubulustyps korreliert. Zudem wies die Anzahl an Tubuli seminiferi contorti mit Ki-67-positiven Spg mit fortschreitender tubulärer Entwicklung einen positiv linearen Trend auf.
Das Vorkommen apoptotischer Ereignisse wurde durch Nachweis der Expression der Caspase-3 sowohl auf Protein- (Immunhistochemie) als auch auf mRNA-Ebene (RT-PCR, RT-qPCR) erfasst. Die Spezifität der IHC wurde vor deren Anwendung durch Vergleich mit der TUNEL Methode unter Verwendung von caninem lymphatischen Gewebe verifiziert. Dennoch zeigten sich bei der Anwendung auf caninem Hodengewebe unspezifische Färbungen, sodass ausschließlich eindeutig identifizierbare, kräftige Signale bei der deskriptiven Auswertung berücksichtigt wurden. Obwohl grundsätzlich nur wenige apoptotische Signale auftraten, zeigte sich in allen DGs der Versuchsgruppe „Gonazon®“ eine gegenüber der “Kontrolle adult“ erhöhte Anzahl apoptotischer Ereignisse. Zudem erschien die in der DG A beobachtete Anzahl apoptotischer Zellen höher als in der DG D. Die RT-qPCR zeigte keinen Effekt der Downregulation.
Versuchsgruppe „Profact®“
Der testikuläre Entwicklungsstand der Rüden der Versuchsgruppe „Profact®“ wies hinsichtlich des morphologischen Erscheinungsbildes, der Expression des ARs sowie des Vorkommens proliferativer und apoptotischer Ereignisse keine signifikanten Unterschiede gegenüber der Versuchsgruppe „Gonazon®“ DG A auf. Subjektiv jedoch schien die Downregulation mit „Profact® Depot“ etwas stärkere Wirkungen hervorzurufen als die Downregulation mit „Gonazon®“.

Versuchsgruppe „juvenil“
Der funktionelle Zustand des Hodengewebes der 2 bis 2,5 Monate alten Hunde unterschied sich deutlich von dem der Versuchsgruppen „Gonazon®“ DGA und „Profact®“. Die tubuläre Querschnittsfläche der juvenilen Tieren war tendenziell kleiner. Das Keimepithel wies ein obstruiertes Lumen auf und beherbergte große und kleine Gonozyten sowie eine erhöhte Anzahl an SZ. Der AR war immunhistochemisch lediglich in den LZ nachweisbar und wies auf mRNA-Ebene (RT-qPCR) eine gegenüber den Versuchsgruppen „Gonazon®“ DGA und „Profact®“ signifikant niedrigere Expression auf. Die Anzahl der apoptotischen Ereignisse lag deutlich niedriger als in den Versuchsgruppen „Gonazon®“ DG A und „Profact®“, wenngleich kein Unterschied auf mRNA-Ebene zu verzeichnen war.