1 Grundlagen zur histologischen Technik

1.1 Einleitung

Die Kenntnis der grundlegenden Prinzipien von häufig verwendeten Techniken ist für das Verständnis der histologischen Grundlagen von großer Bedeutung. Es soll daher vor der Besprechung der Zellen und Gewebe kurz auf wichtige Methoden der Histologie und Zytologie eingegangen werden.

Nur wenige Zellen und Gewebe können ohne Weiteres im lebenden Zustand untersucht werden. In der Regel setzt die mikroskopische Untersuchung eine längere Vorbehandlung der entnommenen Zell- und Gewebsproben voraus. Im Prinzip läuft sie in folgenden wesentlichen Schritten ab ( Abb. 1-1):

• Fixierung

• Einbetten

• Schneiden

• Färben der Schnitte

• Einschließen der histologischen Präparate

1.2 Fixierung

Durch Fixierung (Haltbarmachung) des Gewebes sollen autolytische Vorgänge verhindert und die Zellstruktur in einem möglichst natürlichen Zustand erhalten werden. Darüber hinaus werden durch die meisten Fixierungsmittel auch Bakterien und andere Mikroorganismen abgetötet, die zur Fäulnis und damit gleichfalls zum Gewebsabbau führen würden. Allerdings gelingt eine optimale Erhaltung der zellulären Struktur auch mit den besten Fixierungsmitteln nur zum Teil. Besonders wichtig für den chemisch komplexen Fixierungsvorgang ist die Ausbildung von Querverbindungen zwischen den Eiweißmolekülen (Eiweißfällung). Einige der am häufigsten verwendeten Fixierungsmittel, wie Formaldehyd und Glutaraldehyd, bewirken eine besonders ausgeprägte Proteinvernetzung, indem das Fixierungsmittel Methylen-Brücken zwischen einzelnen Proteinmolekülen bildet. Bei guter Fixierung enthält das resultierende Proteingel alle Strukturen in der Beziehung, wie sie auch in der lebenden Zelle vorliegen. Das Erscheinungsbild (Äquivalentbild) einer fixierten Zelle stimmt dann gut mit dem lebender Zellen überein. Durch die Eiweißfällung erhält das Gewebe eine fest-elastische Konsistenz, die auch für das spätere Schneiden mit dem Mikrotom wichtig ist.

Bei der üblichen histologischen Routinetechnik erfolgt die Fixierung durch Einbringen einer kleinen Gewebsprobe (Kantenlänge einige mm) in wässriges Formol (4–10%) oder in eines der gebräuchlichen Fixierungsgemische, z.B. Bouin-Lösung (Immersionsfixierung). Zur Entnahme des Gewebes sollten dabei Rasierklingen oder ein scharfes Skalpell benutzt werden, um eine mechanische Schädigung der Proben zu vermeiden. Die Fixierung kann aber auch mittels Durchspülen des zu fixierenden Organs bzw. des ganzen, anästhesierten Versuchstiers über das Gefäßsystem (Perfusionsfixierung) erfolgen. Die Perfusionsfixierung wirkt schnell und gleichmäßig und wird vor allem für Zwecke, bei denen eine optimale Strukturerhaltung notwendig ist, z.B. bei der Elektronenmikroskopie, in großem Umfang eingesetzt. Bei den üblichen Routineverfahren wird das Fixierungsmittel nach geeigneter Einwirkungsdauer mittels fließender Wässerung bzw. durch Einbringen in Pufferlösungen wieder ausgewaschen. Nach Fixierung mit Bouin-Lösung wird das Fixierungsgemisch durch Überführen in 70% igen Alkohol entfernt. Die Fixierung kann zur Bildung von Strukturen im Gewebe führen, die in den lebenden Zellen nicht vorkommen. Solche Veränderungen werden als Fixierungsartefakte bezeichnet.

1.3 Einbettung

Zur Vorbereitung für die Einbettung wird die Gewebsprobe durch eine Alkoholreihe von zunehmender Konzentration geführt und dabei schrittweise entwässert (Dehydrierung). Nach Behandlung mit geeigneten Zwischenflüssigkeiten (intermedien), z.B. Xylol, die sowohl mit Alkohol als auch mit dem Einbettungsmedium mischbar sind und durch die der Alkohol aus dem Gewebe verdrängt wird, kann das Präparat mit einem Einbettungsmedium durchtränkt werden. Am häufigsten verwendet man dazu auf 60 °C erhitztes Paraffin. Beim Auskühlen erstarrt das Paraffin und formt zusammen mit der eingebetteten Gewebsprobe einen Präparatblock, der dann geschnitten werden kann. Eine Paraffineinbettung dauert bei einer mittelgroßen Probe etwa einen Tag. Bei anderen Verfahren, z.B. bei der Celloidineinbettung (die für bestimmte Organe, wie das Auge, besonders geeignet ist) kann der Einbettungsvorgang einen Zeitraum von mehreren Wochen in Anspruch nehmen.

1.4 Schneiden des Präparatblocks

Das Schneiden der eingebetteten Präparate erfolgt mit einem speziellen Instrument, dem Mikrotom (Rotationsoder Schlittenmikrotom). Damit werden z.B. aus in Paraffin eingebettetem Material 5–10 μm dicke Schnitte hergestellt und auf entfettete Glasobjektträger aufgezogen.

Nicht eingebettete Präparate können nach Schockgefrierung (z.B. in mit flüssigem Stickstoff gekühltem Isopentan) mit einem Gefriermikrotom oder mittels eines Kryostats (Mikrotom in einer Kühlkammer) geschnitten werden. Das schnelle Einfrieren verhindert die Bildung von Eiskristallen, die sonst zu Artefakten im Gewebe führen würden. Gefrierschnitte werden für bestimmte histochemische Verfahren (z.B. histochemische Lipid- oder Enzymnachweise, bei denen die Gefahr besteht, dass durch den Einbettungsvorgang die nachzuweisenden Substanzen herausgelöst werden) und als Schnellschnittmethode bei Operationen verwendet. Dabei kann noch während einer Operation entschieden werden, ob es sich bei der entnommenen Probe um gutartiges oder maligne entartetes Gewebe handelt. Das Ergebnis liegt vor, während sich der Patient noch in Narkose befindet und der Chirurg kann sofort über das weitere Vorgehen entscheiden.

Eine besonders schonende Methode ist die Gefriertrocknung. Diese Technik umfasst das Schockfrieren der Gewebsprobe und seine anschließend langsame Entwässerung bei niedriger Temperatur im Vakuum. Durch dieses Vorgehen werden nur wenige Substanzen extrahiert und die Strukturveränderungen sind gering. Da bei dieser Methode die Aktivität von Enzymen kaum verändert wird, wird sie bei enzymhistochemischen Untersuchungen eingesetzt.

1.5 Färben der Schnitte

Für lichtmikroskopische Untersuchungen folgt dem Schneiden der Präparate die Entfernung des Einbettungsmittels und das Färben der Schnitte. Die Anzahl der verschiedenen Färbeverfahren für Zellen und Gewebe ist außerordentlich groß. Eine Zusammenstellung einiger wichtiger Färbungen ist in Tabelle 1-1 vorgenommen. Durch unterschiedliche Anfärbung entstehen im Gewebe Kontraste, durch die bestimmte Strukturen besonders hervorgehoben werden. Viele Standardmethoden der Histologie verwenden dazu eine Färbung mit je einem sauren und einem basischen Farbstoff. Freie basische Gruppen des Gewebes haben eine Affinität zu sauer reagierenden Farbstoffen (Azidophilie der Struktur), während saure Gruppen im Gewebe basisch reagierende Farbstoffe binden (Basophilie). Am häufigsten wird für routinemäßige Untersuchungen die Hämatoxylin-Eosin-Färbung verwendet. Durch den basischen Farbstoff Hämatoxylin werden die Zellkerne blau, durch den sauren Farbstoff Eosin das Zytoplasma der Zellen in einem roten Farbton angefärbt.

Daneben ist es möglich, durch spezifische Farbstoffe und Techniken selektiv bestimmte Zellen und Gewebsstrukturen anzufärben. Bei bestimmten Farbstoffen färbt sich die Gewebsstruktur in einem anderen Farbton als sie der Farbstoff selbst aufweist. Eine solche Farbveränderung wird als Metachromasie bezeichnet (griechisch: meta = nach, zwischen; chroma = Farbe). Wichtige metachromatisch wirkende Farbstoffe sind die Thiazinfarbstoffe Toluidinblau und Thionin. Typisch metachromatisch verhalten sich beispielsweise die Granula der Mastzellen, die Heparin, ein stark saures sulfatiertes Glukosaminoglykan, enthalten. Die Metachromasie dürfte allgemein auf das Vorkommen von dicht benachbarten und in großer Zahl vorliegenden sauren Gruppen in den organischen Molekülen zurückzuführen sein.

1.6 Wichtige Färbeverfahren

1.6.1 Alcianblau-Färbung

Alcianblau-Färbung wird zur selektiven Färbung von sauren Glykosaminoglykanen verwendet, wie sie z.B. bei Müzinen oder in der Knorpelgrundsubstanz vorkommen. Bei pH 1,0 werden bevorzugt Karboxylgruppen enthaltende Glykosaminoglykane angefärbt, bei pH 2,5 solche, die Sulfatgruppen aufweisen. Diese Strukturen färben sich blau an. Die Zellkerne können mit Kernechtrot gegengefärbt werden. In der Kombination mit der PAS-Reaktion (Perjodsäure-Schiff-Reaktion) ist eine gleichzeitige Darstellung von sauren und neutralen Glykosaminoglykanen möglich.

1.6.2 Eisenhämatoxylin-Färbung

Diese Färbung eignet sich gut zur...