Kanine Meningeome: histologische und immunhistologische Charakterisierung mit Etablierung neuer immunhistologischer Marker

Ziel dieser Arbeit war es, zum einen die kaninen Meningeome der letzten zehn Jahre aus dem Institut für Veterinär-Pathologie der Justus-Liebig-Universität anhand von objektiven histologischen Kriterien zu reevaluieren und neue wertvolle diagnostische und prognostische immunhistologische Marker zu etablieren. Zum anderen befasste sich die Arbeit damit, kanine Meningeomzellen in Kultur zu bringen und zu charakterisieren, um diese in folgenden Versuchen als Modell für den Einsatz von Chemotherapeutika zur Behandlung von kaninen Meningeomen nutzen zu können.
Für die Charakterisierung kaniner Meningeome gibt es zum aktuellen Zeitpunkt keine einheitliche Grundlage. Die zuletzt veröffentlichte veterinärmedizinische Klassifikation der Tumoren des zentralen Nervensystems stammt aus dem Jahr 1999 (Koestner et al., 1999). Vergleicht man diese mit aktueller veterinärmedizinischer Literatur und mit der aktuellen humanmedizinischen Klassifikation der Tumoren des zentralen Nervensystems von Louis et al. (2016), wird deutlich, dass sie zwar die wichtigsten Subtypen benennt, jedoch unzureichend ist was die Bewertung von Malignitätskriterien angeht. Legt man wie in dieser Arbeit erfolgt, die neueste humanmedizinische Klassifikation zugrunde, stellt man fest, dass zehn der 24 Meningeome ein meningotheliales und acht ein transitionales Wachstumsmuster zeigten. Vom fibrösen, mikrozystischen, psammomatösen, papillären, klarzelligen und granularzelligen Subtyp lag jeweils ein Tumor vor. Dreizehn der 24 kaninen Meningeome aus dem Patientengut waren als atypisch (Grad II) und sieben als anaplastisch (Grad III) einzustufen. Lediglich vier der kaninen Meningeome erhielten eine Einteilung in Grad I. Somit waren 17 % der Meningeome dem Grad I zuzuordnen, 54 % dem Grad II und 29 % dem Grad III. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, den bisher durchweg als benigne beschriebenen Charakter kaniner Meningeomen zu hinterfragen.
Zehn der Hunde aus dem Patientengut wurden einer Resektionsoperation unterzogen, wobei drei die Operation oder die frühe Erholungsphase nach der Operation nicht überlebten. Die übrigen sieben Hunde erreichten einen guten Grad der Regeneration und überlebten im Durchschnitt 43 Wochen, im günstigsten Fall sogar 120 Wochen. Bei vier der besagten Hunde gaben die Besitzer bei der Befragung an, dass eine Euthanasie aufgrund wiederkehrender Symptomatik bzw. wiederkehrender epileptischer Anfälle stattfand. Dies lässt die Vermutung zu, dass ein Rezidiv des Meningeoms vorlag, welches zu der wiederkehrenden Symptomatik geführt hat. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Resektion zwar mit einem hohen Risiko für den Patienten einhergeht, aber durchaus mittelfristig gute Therapieerfolge erzielt. Auch die Tatsache, dass kanine Meningeome nach Resektion scheinbar zu Rezidiven neigen, lässt die Vermutung zu, dass maligne Eigenschaften vorliegen.
Im immunhistologischen Teil dieser Arbeit wurden die kaninen Meningeome zunächst mit den bereits etablierten Antikörpern Vimentin, Zytokeratin, S100 und GFAP untersucht. Die Ergebnisse decken sich mit der aktuellen Literatur und zeigen, dass 23 der 24 untersuchten kaninen Meningeome Vimentin exprimieren. Eine Expression von Zytokeratin war bei sieben der 24 Meningeomen und S100 bei 14 der 24 Meningeomen zu beobachten. Lediglich eines der Meningeome aus dem vorliegenden Patientengut zeigte eine Expression von GFAP. Es wird deutlich, dass ein diagnostisch spezifischer Marker bisweilen fehlt. Daraufhin wurden die Marker Desmoplakin und Phospho-Histon-H3 an kaninem Gewebe etabliert. Hier zeigte sich, dass kanine Meningeomzellen wie ihre humanen Vertreter Desmoplakin exprimieren, jedoch in unterschiedlicher Stärke. Dreiundzwanzig der 24 Meningeome aus der vorliegenden Gruppe zeigten eine Expression von Desmoplakin nach immunhistochemischer Darstellung. Diese Beobachtung macht Desmoplakin zu einem potenziellen Marker für die Diagnostik kaniner Meningeome. Mittels Markierung mit PHH3 lassen sich Mitosefiguren im kaninen Gewebe gut und zuverlässig darstellen. Eine quantitative Bewertung wird vereinfacht und ist durch die zuvor durchgeführte Färbung auch für ungeübte Betrachter möglich. Ebenso ist eine elektronische Auszählung mithilfe passender Software denkbar. Bezogen auf die vorliegenden Patienten ist der mitotische Index mit dem Grad des jeweiligen Meningeoms assoziiert. Der durchschnittliche mitotische Index bei den Grad I Meningeomen liegt bei 2, bei den Grad II Meningeomen bei 7,8 und bei den Grad III Meningeomen bei 56,3. Es ist jedoch zu bedenken, dass er ein wichtiger Faktor bei der zuvor durchgeführten Klassifizierung der Meningeome war. So ist der Mitosemarker PHH3 als möglicher prognostischer Marker für kanine Meningeome anzusehen. Im vorliegenden Patientengut lag kein Zusammenhang zwischen dem Subtyp der Meningeome und dem Expressionsmuster der immunhistologischen Marker vor. Daher dienen die Marker Vimentin, Zytokeratin, S100 und GFAP sowie der neu etablierte Marker Desmoplakin zwar als diagnostische Marker, in dem sie hilfreich bei der Diagnosestellung sind, jedoch nicht als prognostische Marker, denn sie geben keinen Hinweis auf das biologische Verhalten des jeweiligen Meningeoms. Weiterhin konnte zumindest in dieser kleinen Population keine Korrelation zwischen dem histologischen Subtyp und der Prognose für den Patienten nach Meningeomresektion abgeleitet werden, es war jedoch zu beobachten, dass der WHO-Grad des Meningeoms mit dem Verlauf für den Patienten assoziiert ist. Die mittlere postoperative Überlebenszeit der Patienten mit einem Grad II Meningeom lag bei 58,5 Wochen und mit einem Grad III Meningeom bei 39 Wochen.
Im letzten Teil der Arbeit ging es um die Kultivierung und Charakterisierung von kaninen Meningeomzellen in vitro. Es zeigte sich, dass es grundsätzlich möglich ist, Zellen aus kaninen Meningeomen in Kultur zu bringen. Die Zellen waren in ihrer Morphologie deutlich bipolar mit gekrümmtem zytoplasmatischen Saum (Abb. 25). Zur Charakterisierung wurden zwei verschiedene Methoden ausprobiert, zum einen die Immunfluoreszenz an fixierten Zellen und zum anderen die Immunhistochemie am Formalin-fixierten paraffin-eingebetteten Zellpellet. Beide Methoden wurden zunächst mit humanen Meningeomzellen getestet, da Frischmaterial aus kaninen Meningeomen sehr rar ist. Hierbei bewährte sich die Zellpellet-Methode gegenüber der Immunfluoreszenz. Im Anschluss wurde diese mit Zellen eines meningothelialen Meningeoms eines 8-jährigen weiblich-kastrierten Mischlings durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Methode auch bei kaninen Zellen anzuwenden und somit eine Charakterisierung möglich ist, jedoch sollte dies mit einer größeren Anzahl verschiedener Zellpopulationen weiter evaluiert werden. The aim of this study was on the one hand to re-evaluate the canine meningiomas of the last ten years from the Institute of Veterinary Pathology of the Justus-Liebig-University on the basis of objective histological criteria and to establish new valuable diagnostic and prognostic immunohistological markers. On the other hand, the work was focused to culture canine meningeoma cells in vitro and to characterize them in order to be able to use them in subsequent experiments as a model for the use of chemotherapeutic agents for the treatment of canine meningiomas.
There is currently no uniform basis for the characterization of canine meningiomas. The most recently published veterinary classification of tumours of the central nervous system was published in 1999 (Koestner et al., 1999). If compared with current veterinary literature and with the current human medical classification of central nervous system tumors by Louis et al. (2016), it becomes clear that it names the most important subtypes, but is insufficient in terms of evaluating malignancy criteria. If, as in this study, the most recent human medical classification is used, ten of the 24 meningiomas showed a meningothelial and eight a transitional growth pattern. Of the fibrous, microcystic, psammomatous, papillary, clear- and granular-cell subtypes there was one tumor each. Thirteen of the 24 canine meningiomas from the patient population were classified as atypical (grade II) and seven as anaplastic (grade III). Only four of the canine meningiomas were classified as grade I. Thus 17 % of the meningiomas were classified as grade I, 54 % as grade II and 29 % as grade III. These results indicate that the character of canine meningiomas, which has been described as benign, should be questioned.
Ten of the dogs from the patient population underwent resection surgery, three of which did not survive surgery or the early recovery period after surgery. The remaining seven dogs reached a good degree of regeneration and survived an average of 43 weeks, in the best case even 120 weeks. In four of these cases, the owners reported that euthanasia was performed due to recurrent symptoms or recurrent epileptic seizures. This allows the suspicion that there was a recurrence of the meningioma which led to the recurring symptoms. These results show that although resection is associated with a high risk for the patient, it does achieve good therapeutic success in the medium term. Also the fact that canine meningiomas seem to be prone to recurrence after resection allows the assumption that malignant features are present.
In the immunohistological part of this work, the canine meningiomas were first examined with the already established antibodies vimentin, cytokeratin, S100 and GFAP. The results are consistent with the current literature and show that 23 of the 24 canine meningiomas examined express vimentin. An expression of cytokeratin was observed in seven of the 24 meningiomas and S100 in 14 of the 24 meningiomas. Only one of the meningiomas from the present patient population showed expression of GFAP. A diagnostically specific marker is not established yet. As a next step, the markers desmoplakin and phospho-histon-H3 were established on canine tissue. It was shown that canine meningioma cells express desmoplakin like their human counterparts, but at different levels. Twenty-three of the 24 meningiomas from the present group showed an expression of desmoplakin after immunohistochemical labelling. This observation makes desmoplakin a potential marker for the diagnosis of canine meningiomas. Mitotic figures can easily be visualized in canine tissue by labelling with PHH3. A quantitative evaluation is simplified and also possible for untrained observers due to the staining procedure performed previously. Electronic counting with the help of suitable software is also a possibility. In relation to the patient population, the mitotic index is associated with the grade of the respective meningioma. The average mitotic index for grade I meningiomas is 2.0, for grade II meningiomas 7.8 and for grade III meningiomas 56.3, but it should be remembered that it was an important factor in the classification of meningiomas performed previously. Thus, the mitotic marker PHH3 can be considered as a possible prognostic marker for canine meningiomas. In the present patient material there is no correlation between the subtype of meningiomas and the expression pattern of immunohistological markers.
Although the markers vimentin, cytokeratin, S100 and GFAP, as well as the newly established marker desmoplakin are useful as diagnostic markers by being helpful in making a diagnosis, they are not prognostic markers because they do not provide any information of the biological behavior of the respective meningioma. Furthermore, at least in this small population no correlation between the histological subtype and the prognosis for the patient after meningioma resection could be detected, but it was found that the WHO grade of meningioma is associated with the outcome for the patient. The mean postoperative survival time of patients with a grade II meningioma was 58.5 weeks and with a grade III meningioma 39.0 weeks.
The last part of the work was focused on the cultivation and characterization of canine meningioma cells in vitro. It was shown that it is basically possible to culture cells from canine meningiomas. The cells were clearly bipolar in their morphology with a curved cytoplasmic border (Fig. 25). For characterization two different methods were tested, immunofluorescence on fixed cells and immunohistochemistry on formalin-fixed paraffin-embedded cell pellets. Both methods were initially tested with human meningioma cells, since fresh material from canine meningiomas is very rare. Here, the cell pellet method proved to be superior to immunofluorescence. Finally, this was performed with cells from a meningothelial meningioma of an 8-year-old female castrated mixed-breed dog. The results show that the method can also be applied to canine cells and therefore a characterization is possible, but this should be further evaluated with a larger number of different cell populations.