Grundlagen der Licht- und Elektronenmikroskopie

Dr. Susanne Kühl, Studium und Promotion in den Naturwissenschaften an der Universität Ulm. Seit vielen Jahren ist sie auf dem Gebiet der Grundlagenforschung im Bereich der Entwicklungsbiologie tätig und hat zahlreiche Abschlussarbeiten in den Life Sciences betreut. Lehrveranstaltungen führt sie in den Fächern Entwicklungsbiologie und Biochemie sowie zum Thema Lernstrategien und Prüfungsvorbereitung in den Life Sciences durch. Weiterhin ist sie an der Konzeptionierung von neuen Lehrformaten beteiligt. 2015 Abschluss des Zertifikats für Hochschuldidaktik Baden-Württemberg, derzeit Studium des Masters of Medical Education (MME) in Deutschland. Seit einigen Jahren Autorin und Reihenherausgeberin von Life Science-Lehrbüchern des Ulmer Verlags.

Dipl.-Biol. Alexander Linnemann, Studium an der Biologie in Münster, Abschluss als Diplom-Biologe. Danach Tätigkeit als Ökologe mit dem Schwerpunkt in ökologische Bestandsaufnahmen, deren Auswertung und Begutachtung mit Methoden der Fernerkundung und Kartographie in verschiedenen Unternehmen und in der Selbständigkeit. Über 10 Jahre Produktentwicklung von Software und Kameras für die Lichtmikroskopie bei einem großen Hersteller für Mikroskope und medizinische Geräte. Seit 2013 wissenschaftlicher Mitarbeiter an der Universität Ulm. Methodische Schwerpunkte der Forschung sind die Mikroskopie, Bildakquisiton und Bildanalyse.

Danksagung11

Vorwort und Einführung15

I Von der Strahlenoptik zum einfachen Mikroskop19

1 Optische Grundlagen – Strahlenoptik 20

1.1 Was ist Licht? – Ein historischer Überblick20

1.2 Lichtquellen: Selbst- und Nichtselbstleuchter26

1.2.1 Wie entsteht Licht?26

1.3 Begriffe der Strahlenoptik27

1.3.1 Lichtstrahl und Strahlenbündel27

1.3.2 Punktlichtquellen zur einfachen grafischen Darstellung von Strahlengängen28

1.4 Axiome der Strahlenoptik29

1.4.1 Erstes Axiom der Strahlenoptik30

1.4.2 Zweites Axiom der Strahlenoptik30

1.4.3 Drittes Axiom der Strahlenoptik36

1.4.4 Viertes Axiom der Strahlenoptik36

1.5 Brechung des Lichts beim Durchgang durch verschiedene optische Bauelemente 37

1.5.1 Planparallele Platte37

1.5.2 Brechung an kugelförmigen Grenzflächen 38

1.5.3 Brechung an Linsen 40

1.6 Wie entstehen Bilder?45

1.6.1 Abbildungen durch Linsen45

1.6.2 Abbildungen durch Prismen55

1.6.3 Abbildungen durch Spiegel 57

1.7 Zusammenfassung58

2 Auge, Lupe und einfaches Mikroskop59

2.1 Das Auge 59

2.1.1 Der Aufbau des menschlichen Auges 59

2.1.2 Netzhaut 60

2.1.3 Dioptrik des Auges62

2.2 Optische Instrumente und Vergrößerung72

2.2.1 Lupe73

2.2.2 Vergrößerungsglas, Lupe und einfaches Mikroskop 75

2.3 Zusammenfassung80

II Das zusammengesetzte Mikroskop81

3 Allgemeines zum Mikroskop 82

3.1 Der Strahlengang eines Mikroskops82

3.2 Die Vergrößerung durch das Mikroskop 85

3.3 Das zusammengesetzte und das einfache Mikroskop im Vergleich 89

3.4 Zusammenfassung91

4 Der Aufbau eines Mikroskops92

4.1 Allgemeiner Aufbau eines Mikroskops 92

4.2 Die mechanischen Bestandteile eines Mikroskops 92

4.2.1 Stative92

4.2.2 Mikroskoptuben 96

4.2.3 Objekttische100

4.3 Zusammenfassung103

5 Mikroskopobjektive104

5.1 Objektive mit endlicher und unendlicher Bildweite 104

5.1.1 Objektive mit endlicher Bildweite104

5.1.2 Objektive mit unendlicher Bildweite 106

5.2 Vergrößerung und Abbildungsmaßstab107

5.3 Die numerische Apertur110

5.3.1 Bedeutung der numerischen Apertur111

5.3.2 Numerische Apertur und Öffnungswinkel112

5.3.3 Numerische Apertur und Immersion 113

5.4 Homogene Immersion114

5.5 Immersionsmittel und -objektive 116

5.5.1 Immersionsmittel 116

5.5.2 Anwendung eines Immersionsobjektivs118

5.6 Numerische Apertur und förderliche Vergrößerung119

5.7 Abbildungsfehler und deren Korrektion120

5.7.1 Abbildungsfehler120

5.7.2 Monochromatische Aberrationen120

5.7.3 Chromatische Aberration 124

5.8 Korrektionsklassen oder Objektivklassen125

5.8.1 Der Achromat125

5.8.2 Fluoritobjektive oder Semiapochromate 127

5.8.3 Der Apochromat 127

5.8.4 Planobjektiv129

5.9 Spezialobjektive 130

5.9.1 Objektive mit Quarzglas130

5.9.2 Phasenkontrastobjektive131

5.9.3 Objektive für die Polarisationsmikroskopie131

5.10 Deckglasdicke131

5.11 Korrektionsring bei Objektiven 133

5.12 Federfassung zum Schutz der Frontlinse133

5.13 Objektive mit Irisblende134

5.14 Zusammenfassung136

6 Mikroskopokulare137

6.1 Allgemeines zum Okular137

6.2 Okulartypen 141

6.3 Okularangaben und ihre Bedeutung 144

6.3.1 Vergrößerung144

6.3.2 Sehfeldzahl144

6.3.3 Großfeld- oder Weitwinkelokulare 147

6.3.4 Dioptrienausgleich147

6.3.5 Brillenträgerokular147

6.4 Okulare für Demonstrations-, Zähl- oder Messzwecke 148

6.5 Zusammenfassung152

7 Die Beleuchtungseinrichtung eines Mikroskops 153

7.1 Die Beleuchtung 153

7.2 Lichtquellen und ihre optimale Einstellung154

7.3 Der Kondensor155

7.3.1 Allgemeiner Aufbau eines Kondensors 155

7.3.2 Funktion des Kondensors: Ausleuchtung des Präparats 155

7.3.3 Funktion des Kondensors: Beleuchtungsapertur157

7.3.4 Einstellung der Kondensorblende158

7.3.5 Bauformen von Kondensoren161

7.4 Mikroskopbeleuchtungen 163

7.4.1 Die kritische Beleuchtung163

7.4.2 Die Köhlersche Beleuchtung164

7.5 Zusammenfassung174

8 Einteilung der Mikroskope175

8.1 Kursmikroskope 175

8.2 Routine- oder Labormikroskope178

8.3 Forschungsmikroskope oder Universalmikroskope178

8.4 Zusammenfassung180

9 Stereomikroskope und Makroskope181

9.1 Stereomikroskope 181

9.1.1 Greenough-Systeme oder Greenough-Mikroskope183

9.1.2 Teleskop- oder Fernrohrsysteme 184

9.1.3 Beleuchtung 185

9.1.4 Anwendungsgebiete185

9.2 Makroskope186

9.3 Zusammenfassung187

III Theorie der mikroskopischen Abbildung189

10 Grundlagen der Wellenoptik190

10.1 Der dunkle Raum: Warum die Wellenoptik zum Verständnis des Mikroskops so bedeutend ist 190

10.2 Optische Beugung und Interferenz194

10.3 Schwingungen198

10.4 Wellen 199

10.4.1 Mathematische Beschreibung von Wellen 201

10.4.2 Wasserwellen als Modell für Transversalwellen 203

10.4.3 Ausbreitung von Lichtwellen 204

10.5 Interferenz von Wellen 205

10.5.1 Wasserwellen205

10.5.2 Lichtwellen206

10.6 Modelle zur Lichtwellenausbreitung: Huygens-Fresnelsches Prinzip und Fresnelsche Beugung 209

10.7 Fresnelsche und Fraunhofersche Beugungen218

10.8 Zusammenfassung220

11 Beugung im Mikroskop221

11.1 Beobachtung von Beugungsbildern222

11.1.1 Die Beugung von Licht in der Fraunhofer-Versuchsanordnung222

11.1.2 Die Beugung von Licht im Abbeschen Diffraktionsapparat223

11.1.3 Möglichkeiten zur Beobachtung des primären Beugungsbildes im normalen, aufrechten Mikroskop224

11.2 Einfachspalt, Doppelspalt und optische Gitter 225

11.2.1 Di Beugung von Licht am Einfachspalt226

11.2.2 Beugung am Doppelspalt und am Strichgitter 230

11.2.3 Kreuzgitter234

11.3 Mikroskopische Präparate als Beugungsgitter 236

11.4 Bedeutung der Lichtbeugung für die Bild-entstehung: Ausblenden der Nebenmaxima 237

11.5 Zusammenfassung239

12 Die Theorie der Bildentstehung nach Abbe240

12.1 Die Abbesche Theorie der mikroskopischen Abbildung 241

12.2 Auflösungsvermögen eines Mikroskops nach Abbe244

12.3 Abbe-Formel für das Auflösungsvermögen eines Mikroskops249

12.4 Auflösungsgrenze des Lichtmikroskops (Abbe-Limit)252

12.5 Das Auflösungsvermögen eines Mikroskops nach von Helmholtz 254

12.6 Auflösungsvermögen und förderliche Vergrößerung254

12.7 Theorie der mikroskopischen Abbildung nach Abbe und der dunkle Raum 258

12.8 Ausblick258

12.9 Zusammenfassung259

IV Elektronenmikroskopische Verfahren261

13 Das Transmissionselektronen-mikroskop262

13.1 Elektronen zur Abbildung von Strukturen prägen die Vorstellungswelt der Biologen263

13.2 Die Geschichte der Elektronenmikroskopie beginnt mit dem Transmissionselektronen-mikroskop 266

13.3 Aufbau und Funktionsweise eines Transmissionselektronenmikroskops274

13.4 Korrektoren zur Minimierung von Linsenfehlern im TEM279

13.5 Bildentstehung im TEM 281

13.6 Möglichkeiten eines Energiefilters im TEM284

13.7 Probenpräparation für TEM289

13.7.1 Objektträger für Untersuchungen im TEM 291

13.7.2 Präparation von Einzelpartikeln für TEM292

13.7.3 Gibt es eine ideale Fixierungsmethode?293

13.7.4 Herstellung von Proben-Dünnschnitten296

13.7.5 Kontrastierung der Proben298

13.7.6 Probenpräparation für analytische EFTEM-Methoden 298

13.8 TEM-Anwendungen in den Lebenswissenschaften 298

13.8.1 Visualisierung von Ultrastrukturen und subzellulärer Lokalisation von Molekülen im TEM 298

13.8.2 Analyse von biologischen Proben durch Kryo-TEM 299

13.8.3 Einsatz des TEM in der Strukturbiologie 300

13.8.4 3D im TEM – TEM-Tomographie 301

13.9 Die Interpretation von TEM Aufnahmen 303

13.10 Limits und Trends in der Transmissionselektronenmikroskopie 304

13.11 Zusammenfassung 305

14 Das Rasterelektronenmikroskop 307

14.1 Rasterelektronenmikroskopie – Fortsetzungsreise ins Reich der kleinen Dinge 307

14.1.1 Allgemeines Funktionsprinzip des REM 308

14.1.2 Die Geschichte der Rasterelektronenmikroskopie 308

14.2 Aufbau eines Rasterelektronenmikroskops 313

14.2.1 Elektronenstrahlerzeugende Systeme und Elektronenemitter 313

14.2.2 Linsen 322

14.2.3 Rastereinheit 326

14.3 Bildentstehung im REM: Wechselwirkungen zwischen Elektronenstrahl und Probe und ihr Informationsgehalt 328

14.4 Detektion und Kontraste 337

14.4.1 Everhart-Thornley-Detektor (ETD) 338

14.4.2 Dedizierte Rückstreuelektronendetektoren 341

14.4.3 Spezielle Detektoren und Abbildungsverfahren 343

14.4.4 Die Bedeutung von Kontrast, Signal und Rauschen 348

14.5 Wie kommt man zu einem guten Bild? – Probenpräparation und Einstellungen am REM 350

14.6 Trends in der Rasterelektronenmikroskopie 354

14.7 Zusammenfassung 357

Literaturverzeichnis 359

Kapitel 1–12 359

Kapitel 13 365

Kapitel 14 368

Anhang 371

Symbole und Konstanten 371

Grundgrößen und abgeleitete Größen 372

Brechungsindizes wichtiger Immersionsmittel und Luft 372

Formeln 373

Konventionen 374

Quellennachweis 375

Tabellen 375

Abbildungen 375

Sachverzeichnis 381

Autorenverzeichnis 396