Einfluss der kombinierten mechanischen und biologischen Stimulation auf die Defektheilung – eine mikrocomputertomographische und biomechanische Untersuchung im Pseudarthrosemodell der Ratte

Influence of combined mechanical and biological stimulation on defect healing – a microcomputed tomographic and biomechanical study of critical-sized bone defects in rats

Generally it is known that the mechanical environment (stiffness of stabilization measures) is significant for the healing success of a fracture (Histings et al., 2010; Bartnikowski et al., 2017; Claes, 2017; Glatt et al., 2017). Under which biomechanical conditions a fast and efficient fracture healing would be achievable has been the subject of intensive research for some time (Claes, 2017).
Additionally, several studies have shown the positive effect of BMP-2 for bone healing (Nauth et al., 2011; Wildemann et al., 2011). Extended knowledge of the impact of the dosing of growth factors and how much their interaction with mechanical stress can influence the efficiency of bone regeneration show possible future strategies for cases in which a bony bridging of the fracture gap has not yet been achieved. (Schmidt-Bleek & Willie et al., 2016).
The aim of this work was to analyze the effects of varying fixation stiffness in combination with BMP-2 treatment in a critical sized defect (CSD) in a rat.
32 female Sprague Dawley rats, 12 weeks old, were randomized in four groups each of eight animals. Three experimental groups received a standardised critical 5 mm defect, 5μg rhBMP-2 was loaded on a absorbable collagen sponge and placed into the defect and stabilized with a flexible, semi-ride or rigide connecting element of the external fixator. The control group (1 mm osteotomy) mimicked an uncritical healing and was stabilized with the rigid fixator. All groups were analysed by in vivo micro-CT, perforrmed at day 10, 21 and 42 post-operation. At day 42 the rats were sacrificed and the osteomised left femora (including external fixator) were harvested. Additionally, the right intact femur of seven animals was harvested randomizedly. In the following, all samples were analysed by biomechanical in vitro testing for torsional stiffness and maximal torque value.
The initial healing process of the stiffness groups was found with comparable tissue structure in the descriptive micro-CT. At day 10, in all stiffness groups moderate bone formation was detected along the periosteal defect site that was not sufficient for defect bridging. However, among the other stiffness groups, upon semi-rigid fixation, a tendency towards a higher level of mineralization was still found, which correlates with the largest statistically not significant TV-, BV- und TMC-values. Whereas the flexible group showed the lowest TV-value.
On day 21 defects were bridged with bone tissue in all stiffness groups. As a result of the beginning maturing process, the micro-CT showed reabsorption processes. Delayed healing was found upon flexible fixation towards the other stiffness groups. Also a defect site with calcified and mineralized callus was found.
On day 42, the flexible group showed significantly higher values for TV, BV, BV/TV and TMC, whereas the semi-rigid group showed the smallest of these values. This was seen by a defect site filled with mineralised callus upon flexible fixation, whereas the
other stiffness groups had already shown reabsorption processes with rebuilding of the medullary cavitiy. Regarding TMD, the semi-rigid group showed the highest value, while flexible group showed the lowest value, but without any significance. The rigid group and the semi-rigid group showed a reduction of the total volume (TV) and also lower BV- and TMC-values as the flexible group - but also a lower TMD-value as the semi-rigid group. This leads to the presumption of a delayed maturing process.
By using biomechanical in vitro tests, the semi-rigid group showed nearly equivalent results respective the torsional stiffness and the maximal torque at failure between the rigid and the flexible group.
This study has shown that the BMP-2-stimulated defect healing is mechano-sensitive. Although marginal statistically significant differences in biomechanical and micro-CT results have been found, an accelerated healing process has been demonstraded upon semi-rigide and rigide group contrary to the flexible fixation – indicating a delayed boost of bone formation, whereas other stiffness groups had already shown reabsorption processes with rebuilding of the medullary cavitiy. This leads to the insight that the modulation of the mechanical environment of the critical defect has an impact on the healing process, despite the same BMP-2-treatment. Dass die mechanische Umgebung (Stabilisationssteifigkeit) entscheiden für den Heilungserfolg einer Fraktur ist, wurde mehrfach demonstiert (Histings et al., 2010; Bartnikowski et al., 2017; Claes, 2017; Glatt et al., 2017). Unter welchen biomechanischen Bedingungen eine möglichst schnelle und effiziente Frakturheilung erreichbar wäre, ist seit geraumer Zeit Gegenstand intensiver Forschung (Claes, 2017).
In diversen Studien ist zudem der postitive Effekt von BMP-2 auf die Knochenheilung belegt worden (Nauth et al., 2011; Wildemann et al., 2011). Weitgreifendere Erkenntnisse über die Wirkung der Dosierung des Wachstumsfaktors und inwieweit seine Interaktion mit mechanischer Belastung die Effizienz der Knochenregeneration beeinflusst, eröffnen mögliche Zukunftsstrategien in Fällen wo knöcherne Überbrückung bisher unerreichbar war (Schmidt-Bleek & Willie et al., 2016).
Aufgrund dessen untersuchte die vorliegende Arbeit den Einfluss kombinierter biologischer und mechanischer Stimulation auf die Defektheilung im Pseudarthrosemodell der Ratte. Es sollte untersucht werden, welchen Effekt die variierenden Steifigkeiten eines externen Fixateurs auf die BMP-2-stimulierte Knochendefektheilung ausübte. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, auf Grundlage von mikrocomputertomographischen Untersuchungen und biomechanischer in vitro Testung, den Heilungsverlauf eines kritischen Defekts unter semi-rigider Fixation gegenüber rigider und flexibler Steifigkeit aufzuzeigen.
32 weibliche Sprague-Dawley Ratten in einem Alter von 12 Wochen wurden randomisiert in vier Gruppen von je acht Tieren eingeteilt. Die experimentellen Versuchsgruppen erhielten einen standardisierten kritischen 5 mm Defekt (CSD), eine intraoperative Einbringung von 5μg rhBMP-2 mittels absorbierbaren Kollagenschwamms und wurden mittels variierenden Verbindungsbalken des externen Fixateurs (flexibel, semi-rigide, rigide) stabilisiert, während die Kontrollgruppe eine 1mm Osteotomie ohne rhBMP-2-Applikation erhielt und als positive Kontrolle bezüglich einer physiologischen Knochenheilung diente. Alle Versuchstiere durchliefen am 10., 21. und 42. postoperativen Tag eine in vivo-Mikrocomputertomographuntersuchung. An Tag 42 wurden die Tiere euthanasiert und der linke osteotomierte Femur (inklusive des Fixateurs externe) entnommen. Randomisiert wurden sieben Tieren zusätzlich der intakte rechte Femur entnommen. Sämtliche Proben wurden biomechanisch hinsichtlich Steifigkeit und maximalen Drehmoments getestet.
Die Initialheilung der Steifigkeitsgruppen stellte sich im deskriptiven Mikro-CT mit einer vergleichbaren Gewebezusammensetzung dar. Im Defektspalt war moderat periostale Knochenneubildung erkennbar, die in keiner Defektüberbrückung resultierte. Dennoch ließ die semi-rigide Gruppe tendenziell den höchsten Grad an Mineralisation erkennen, welches mit den größten nicht signifikanten TV-, BV- und TMC-Werten im Vergleich zu den anderen Versuchsgruppen korrelierte, während die flexible Gruppe den kleinsten TV-Wert zeigte.
An Tag 21 stellten sich alle Versuchsgruppen knöchern überbrückt dar. Als Ausdruck der beginnenden Reifung ließen sich im Mikro-CT Resorptionsvorgänge darstellen. Die flexible Gruppe zeigte eine verzögert einsetzende Heilung gegenüber den beiden steiferen Gruppen sowie einen mit verkalktem und mineralisierten Kallusgewebe ausgefüllten Defektspalt.
An Tag 42 zeigte die flexible Gruppe signifikant größere Werte für TV, BV, BV/TV und TMC, während die semi-rigide Gruppe diesbezüglich die kleinsten Werte aufwies. Dies machte sich durch einen mit mineralisiertem Knochengewebe gefüllten Defekt in der flexiblen Gruppe deutlich, während die beiden steiferen Gruppen bereits Resorptionsvorgänge mit Wiederherstellung der Markhöhle erkennen ließen. Bezüglich TMD zeigte die semi-rigide Gruppe den größten Wert und die flexible Gruppe den kleinsten Wert, jedoch ohne Signifikanz. Die rigide Gruppe zeigte wie die semi-rigide Gruppe eine Abnahme des Gesamtkallusvolumens (TV) sowie geringere BV- und TMC-Werte als die flexible Gruppe, jedoch auch einen kleineren TMD-Wert als die semi-rigide Gruppe, weshalb hier ein verzögerter Reifungsprozess vermutet wurde.
Mittels biomechanischer in vitro Testung zeigte die semi-rigide Gruppe annähernd gleichwertige Ergebnisse bezüglich der Steifigkeit und des maximalen Drehmoments wie die rigide und flexible Gruppe.
Die Arbeit hat gezeigt, dass die BMP-2- stimulierte Defektheilung mechano-senitiv ist. Zwar zeigten sich in den biomechanischen und mikrocomputertomographischen Ergebnissen kaum statistisch signifikante Unterschiede, jedoch konnte deskriptiv eine beschleunigte Heilung der semi-rigiden und rigiden Versuchsgruppe gegenüber der flexiblen Fixation demonstriert werden, die in einer verzögerten Knochenheilung resultierte, während die steiferen Gruppen eine Re-Kanalisation der Markhöhle zeigten. Dies führte zu der Erkenntnis, dass die Modulation der mechanischen Umgebung des kritischen Defekts, trotz BMP-2-Anwesenheit, einen Einfluss auf den Heilungsverlauf ausübt.