Prüfung des Einflusses eines pegylierten bovinen Granulozyten-Kolonie stimulierenden Faktors auf das leukozytäre Blutbild und die Akute-Phase-Reaktion von Holstein-Friesian Kühen und deren Kälbern

Hintergrund:
Im peripartalen Zeitraum kommt es bei der Milchkuh aufgrund der steigenden körperlichen Belastung durch die anstehende Kalbung und die beginnende Laktation zu einer Suppression des Immunsystems, die durch geringe Konzentrationen an neutrophilen Granulozyten und einer eingeschränkten Funktion dieser gekennzeichnet ist, was höhere Krankheitsinzidenzen (z. B. Mastitiden) zur Folge hat. Granulozyten-Kolonie stimulierende Faktoren (G-CSF) regen die Bildung von neutrophilen Granulozyten im Knochenmark an und finden beim Rind Einsatz zur Reduktion einer klinischen Mastitis während der immunsupprimierten Transitphase. Es liegen bisher nur wenige Informationen über den Einfluss von G-CSF auf die Akute-Phase-Reaktion (APR) von graviden Milchkühen und einen möglichen Effekt auf ihre Kälber vor.
Ziel der Studie:
Das Ziel dieser Studie war die Evaluation der Auswirkungen des Einsatzes eines G-CSF auf das Immunsystem und das leukozytäre Blutbild der tragenden Kuh zum Zeitpunkt der Geburt und des neugeborenen Kalbes. Die Hypothese dabei war, dass die Verabreichung eines G-CSF bei Muttertier und Kalb zu einer APR und einer Leukozytose mit Neutrophilie führt. Zusätzlich wurden klinische Parameter zur Bewertung möglicher unerwünschter Nebenwirkungen und des Gesundheitszustandes der Tiere ausgewertet.
Material und Methoden:
Der vom Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen nach § 8 Abs. 1 des Tierschutzgesetzes zugelassene Versuch (Aktenzeichen 84-02.04.2017.A096) fand im Zeitraum von Juli bis Dezember 2017 statt. Eingeschlossen wurden Blutproben von 84 Milchkühen und 77 Kälbern der Rasse Holstein-Friesian mit einem vollständigen Datensatz.
Einem Teil der Kühe (41/84) wurde 5 - 15 Tage vor dem Kalbungstermin und innerhalb von 24 h nach der Abkalbung 2,7 ml Imrestor™ (Elanco GmbH, Bad Homburg, Deutschland) mit 15 mg bG-CSF s.c. injiziert, so ergab sich eine Kontrollgruppe mit 43 Tieren. Bei den Kälbern waren 35/77 der behandelten Mütter und 42/77 der Kontrolltiere mit vollständigen Daten.

Jeweils nach einer klinischen Untersuchung erfolgten die Blutentnahmen der Kühe vor der ersten Injektion (Zeitpunkt ap), vor der zweiten Injektion (Zeitpunkt p) sowie jeweils einmal in den darauffolgenden zwei Wochen (Zeitpunkte pp1 und pp2).
Die Blutentnahmen der Kontrolltiere erfolgten zu gleichen Zeitpunkten. Bei den untersuchten Kälbern wurden ebenfalls 4 Blutentnahmen (1. vor der Kolostrumaufnahme (Zeitpunkt n), 2. innerhalb von 24 h danach (Zeitpunkt pn1), 3. erste Lebenswoche (Zeitpunkt pn2), 4. zweite Lebenswoche (Zeitpunkt pn3)) durchgeführt.
Untersucht wurden EDTA- und Serum-Proben. Die hämatologische Untersuchung umfasste eine automatisierte Zellzählung am ADVIA® 2120 (Siemens Healthcare, Erlangen, Deutschland) mit manueller Differenzierung eines nach May-Grünwald-Giemsa gefärbten Blutausstriches. Aus den Serumproben wurden Haptoglobin (Hp), Albumin (Alb) und Totalprotein (TP) am biochemischen Analysegerät ABX Pentra C400 (ABX Horiba, Montpellier, Frankreich) bestimmt.
Weiterhin wurden bei den Kühen klinische Parameter untersucht, wie die Trockenmasse-Aufnahme, Milchleistung, Trächtigkeitsdauer sowie der prozentuale Anteil der Kühe mit gestörtem Allgemeinbefinden, Totgeburten, Fieber, entzündlichen und metabolischen Krankheiten. Außerdem wurde der prozentuale Anteil an Kühen ermittelt, bei denen es nach dem Trockenstellen zu einem Anstieg der Zellzahl in der Milch kam. Die Kälber wurden hinsichtlich ihres Geburtsgewichts verglichen und es wurde das Vorhandensein von entzündlichen Krankheiten ausgewertet.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen:
Die Kühe der Imrestor™-Gruppe zeigten im Vergleich zu den Kühen der Kontrollgruppe einen signifikanten, etwa doppelt so hohen Anstieg der Leukozytenzahl (WBC, p < 0,001), getragen von den neutrophilen Granulozyten (NEU, p < 0,0009) mit einer signifikant höheren Zahl an toxischen neutrophilen Granulozyten (TOX, p < 0,0007) sowie einem häufigeren Auftreten einer Linksverschiebung (p < 0,0018). Außerdem wiesen die behandelten Kühe eine signifikant höhere Zahl der Lymphozyten (LYM, p < 0,0006) und Monozyten (MON, p = 0,001) auf. In der ersten Laktationswoche (Zeitpunkt pp1) zeigte sich bei den Kontrolltieren eine 2-fach höhere Hp-Konzentration (p < 0,0004), die von einer niedrigeren Alb-Konzentration begleitet war (p < 0,0002). Die Kälber, der mit Imrestor™ vorbehandelten Kühe zeigten eine signifikant höhere Zahl an WBC (p < 0,0009), NEU (p < 0,0008) sowie an LYM (p < 0,0006) und MON (p < 0,0007), jedoch war der Effekt geringer als bei den Muttertieren.
Der einzige Effekt des G-CSF auf die klinischen Parameter der Milchkühe im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe war die geringere Häufigkeit des Auftretens von metabolischen Krankheiten (40 % vs. 10 %, p = 0,0022). Bei den Kälbern zeigte die Behandlung der Muttertiere keinen Effekt auf den Gesundheitszustand oder die Entwicklung.
Zusammenfassend konnte die vorliegende Studie zeigen, dass mit Imrestor™ behandelte Kühe nach der Kalbung einen signifikant höheren Anstieg der Leukozytenzahl aufwiesen, was von einer geringer ausgeprägten APR und einer geringeren Häufigkeit des Auftretens von metabolischen Erkrankungen begleitet war. Dies lässt darauf schließen, dass G-CSF einen positiven Effekt auf den Gesundheitszustand der Milchkühe im peripartalen Zeitraum haben.
Die Untersuchungen der Kälber von mit Imrestor™ vorbehandelten Kühen zeigten, ähnlich zu den Ergebnissen der Muttertiere, einen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant höheren Anstieg der untersuchten Leukozytenpopulationen, jedoch waren diese Reaktionen trotz der statistischen Signifikanz deutlich abgeschwächter und klinisch wenig relevant, sodass davon ausgegangen werden kann, dass die Behandlung der Muttertiere mit einem G-CSF keinen negativen Effekt auf die Entwicklung, Gesundheit und Vitalität der neugeborenen Kälber hat.
Da sich bisher nur wenige Daten über die Auswirkungen eines G-CSF auf das leukozytäre Blutbild und die APR der Kälber behandelter Kühe finden und da aufgrund vorliegender humanmedizinischer Studien von einer transplazentaren Übertragung der G-CSF ausgegangen werden muss, sollte das Ziel zukünftiger Studien weitere Untersuchungen hinsichtlich der Folgen einer peripartalen Therapie mit G-CSF für die Neonaten sein. Background:
In the peripartal period, the dairy cow experiences a suppression of the immune system due to the increasing physical stress caused by the upcoming calving and the beginning of lactation, which is characterised by low concentrations of neutrophil granulocytes and an impaired function of these, resulting in higher disease incidences (e. g. mastitis). Granulocyte colony stimulating factors (G-CSF) stimulate the formation of neutrophil granulocytes in the bone marrow and are used in cattle to reduce clinical mastitis during the immunosuppressed transit phase. There is little information available on the influence of G-CSF on the acute phase response (APR) of gravid dairy cows and a possible effect on their calves.

Objectives:
The objective of this study was to evaluate the effects of the use of a G-CSF on the immune system and leukocytic blood count of the pregnant cow at parturition and the newborn calf. The hypothesis was that administration of a G-CSF would lead to APR and leukocytosis with neutrophilia in both dam and calf. In addition, clinical parameters were evaluated to assess possible adverse side effects and the health status of the animals.

Methods:
The study approved by the North Rhine-Westphalia State Office for Nature, Environment and Consumer Protection in accordance with §8 (1) of the Animal Protection Act (file number 84-02.04.2017.A096) took place in the period from July to December 2017. Included were blood samples from 84 dairy cows and 77 calves of the Holstein-Friesian breed with a complete data set. 41/84 cows were injected s.c. with 2.7 ml Imrestor™ (Elanco GmbH, Bad Homburg, Germany) containing 15 mg bG-CSF 5-15 days before calving and within 24 h after calving, resulting in a control group of 43 animals. In the calves, 35/77 of the treated mothers and 42/77 of the control animals had complete data.
In each case, after a clinical examination, the blood samples of the cows were taken before the 1st injection (ap), before the 2nd injection (p) and once each in the following two weeks (pp1 and pp2). The blood samples of the control animals were taken at the same time. In the calves examined, 4 blood samples were also taken (1. before colostrum intake (n), 2. within 24 h afterwards (pn1), 3. first week of life (pn2), 4. second week of life (pn3)).
EDTA and serum samples were examined. The haematological examination included an automated cell count on the ADVIA® 2120 (Siemens Healthcare, Erlangen, Germany) with manual differentiation of a May-Grünwald-Giemsa stained blood smear. Haptoglobin (Hp), albumin (Alb) and total protein (TP) concentration were determined from the serum samples on the ABX Pentra C400 biochemical analyser (ABX Horiba, Montpellier, France).
Furthermore, the cows were examined for clinical parameters such as dry matter intake, milk yield, duration of gestation period and the percentage of cows with disturbed general condition, stillbirths, fever, inflammatory, and metabolic diseases. In addition, the percentage of cows with an increase in the cell count in the milk after dry standing was determined. Calves were compared for birth weight and the presence of inflammatory diseases was evaluated.

Results and Conclusions:
The cows in the Imrestor™ group showed a significant increase in leukocyte count (WBC, p < 0.001), carried by neutrophil granulocytes (NEU, p < 0.0009) with a significantly higher number of toxic neutrophil granulocytes (TOX, p < 0.0007) and a more frequent occurrence of a left shift (p < 0.0018) compared to the cows in the control group. In addition, the treated cows had a significantly higher number of lymphocytes (LYM, p < 0.0006) and monocytes (MON, p = 0.001) compared to controls. In the 1st week of lactation (pp1), the control animals showed a 2-fold higher Hp concentration (p < 0.0004), which was accompanied by a lower Alb concentration (p < 0.0002) than in the study group. The calves of cows treated with Imrestor™ showed significantly higher numbers of WBC (p < 0.0009), NEU (p < 0.0008) and LYM (p < 0.0006) and MON (p < 0.0007), but the effect was smaller than in the dams.
The only effect of G-CSF on the clinical parameters of the dairy cows compared to the untreated control group was the lower incidence of metabolic diseases (40 % vs. 10 %, p = 0.0022).. In the calves, the treatment of the dams showed no effect on health status or development.
In conclusion, the present study showed that Imrestor™-treated cows had a significantly higher increase in leukocyte count after calving, which was accompanied by a lower APR and a lower frequency of metabolic disease. This suggests that G-CSF have a positive effect on the health status of dairy cows in the peripartum period.
The examinations of the calves of cows treated with Imrestor™ showed, similar to the results of the dams, a pronounced increase in the examined leucocyte populations compared to the control group, however, despite the statistical significance, the absolute effect was small and therefore of little clinical relevance. Thus, it can be assumed that the treatment of the dams with a G-CSF has no negative effect on the development, health and vitality of the newborn calves.
Since there are only few data on the effects of G-CSF on the leukocytic blood count and APR of calves of treated cows and since a transplacental transfer of G-CSF must be assumed on the basis of existing human medical studies, the aim of future studies should be to further investigate the consequences of peripartum therapy with G-CSF for the neonates.